مفعول الميلاتونين يبدأ عادةً في خلال 20 إلى 40 دقيقة من تناوله، ويبلغ ذروته بعد حوالي ساعة واحدة. لذلك يُنصح بتناول مكملات الميلاتونين قبل النوم بساعة إلى ساعتين للحصول على أفضل تأثير، حيث يشعر معظم الأشخاص بالنعاس بعد حوالي ساعتين من ارتفاع مستوياته في الجسم. مدة استمرار مفعوله تكون بين 4 إلى 8 ساعات تقريبًا، حسب الجرعة وتركيبة المكمل التي تُستخدم. بعض المصادر تقول إن الشعور بالنعاس قد يبدأ في غضون 15 إلى 30 دقيقة بعد تناول الميلاتونين، ولكنه بشكل عام يستغرق حوالي 30 دقيقة ليبدأ مفعوله بشكل واضح، مع توصية بتناوله قبل موعد النوم بنصف ساعة إلى ساعتين لتحقيق أفضل النتائج.